【前沿资讯】Prime Editing新动向-点突变细胞助力基因治疗临床前研究

Prime editing是一种基于CRISPR/Cas系统改进的基因编辑技术，以在基因组的靶位点处实现精准的片段插入、删除及碱基的任意替换，具有更高的精确性和更低的误差率。 Prime editing一经问世，便引起许多科研工作者的广泛关注，在治疗遗传性疾病、基因突变型疾病和癌症上进行了广泛研究，如通过编辑患者的细胞基因组纠正致病的突变基因，从而治疗遗传性疾病，或通过编辑癌细胞基因组中的致癌基因，阻止其生长和扩散。本文选取了三篇Prime editing临床治疗的文章进行解读，为大家带来最新的Prime Editing研究动向。

一、Prime editingβ助力地中海贫血治疗，HEK293T细胞测序无脱靶更放心

原文链接：https://doi.org/10.3390/ijms23115948

β地中海贫血是一种由血红蛋白(HGB)亚单位β基因(HBB)单基因突变引起的造血系统疾病，导致β-球蛋白异常表达。到目前为止，已经发现了超过300种β-地中海贫血等位基因，其中内含子的点突变是最常见的类型，导致异常剪接位点的激活。

本研究使用prime editor version 3 (PE3)对人β-地中海贫血IVS-II-654突变(C >t)的小鼠模型进行基因修正，将PE3组分微量注射到IVS-II-654小鼠受精卵中，以产生突变编辑小鼠。IVS-II-654位点的基因组测序结果显示，PE3的编辑效率为14.29%；RT-PCR分析显示PE3诱导的基因编辑恢复了β-球蛋白mRNA的正常剪接；地中海贫血症状的综合表型分析显示纠正的IVS-II-654小鼠具有与野生型小鼠相同的正常表型。

研究人员构建了包含Cas9、报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和sgRNA的质粒，将两个靶向不同位点的质粒Peg和Ni转移到人HEK293T细胞中，选择Peg和Ni在人类基因组中最可能产生indel的三个脱靶位点进行深度测序，以进行pegRNA (Peg)和nick sgRNA (Ni)的脱靶分析。结果显示产生indel的效率＜0.35%，说明PE3介导的基因治疗策略对β-地中海贫血IVS-II-654突变具有良好的人类基因组安全性。

图1 Prime editing系统精准高效完成基因编辑治疗β地中海贫血

二、CRISPR-Cas9敲除hPSCs关键基因显著提高PE系统的编辑效率

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.omtn.2023.05.015

人类多能干细胞(hPSCs)的精确基因组编辑在基因疾病建模和体外干细胞治疗方面具有潜在的应用前景。不同于分化完全的体细胞，hPSCs具有保持基因组完整性的独特细胞特性，对基因编辑工具Prime editing的精准度和效率要求更高。

研究人员使用CRISPR-Cas9技术对MMR通路关键蛋白MSH2、MSH3和MSH6纯合子基因进行敲除（分别为M2KO、M3KO和M6KO），进而干扰或降低MutSα和MutSβ复合物的功能，该复合物的活性强弱决定了Prime editing在hPSCs中的编辑效率。MSH2缺失使Prime editing在碱基错配、1~10bp的IDL（indel loop）中编辑效率均有显著提高；MSH3缺失提高Prime editing在3~10bp的IDL中的编辑效率；MSH6缺失提高Prime editing在碱基错配、1~3bp的IDL中的编辑效率；Prime editing系统在敲除MSH2、MSH3和MSH6的hPSCs上总体编辑效率提高了50倍，而MSH2、MSH3和MSH6蛋白的缺失对hPSCs的多能性只产生微小影响，维持着与野生型细胞相似的多能性，通过敲除hPSCs关键基因的研究，有效提高PE系统在人类多能干细胞的编辑效率，为体外干细胞治疗提供可靠基因编辑方案

图2 MSH2、MSH3和MSH6蛋白缺失提高Prime editing系统在hPSCs的编辑效率

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三、PEmax点突变间质干细胞成为治疗遗传性原发性性腺功能减退症新方向

原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202300993

遗传性原发性性腺功能减退症(HPH)是由间质细胞中与睾酮合成相关的激素促黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(LHCGR)发生基因突变引起的，通常会损害男性的性发育和精子发生。

研究人员基于HPH患者相关基因突变建立了一种新的点突变小鼠模型(LhcgrW495X)，通过慢病毒传递PEmax系统成功纠正LhcgrW495X点突变小鼠的间质干细胞（SLCs）的体内突变，并有效再生分化成间质细胞，恢复睾酮生产，重启性发育，恢复精子发生，并产生可育后代，7日内平均纠正率为11.67%，14日内平均纠正率为23.42%，对预测的5个潜在脱靶位点进行了靶向深度测序，未观察到任何可检测到的靶外编辑。研究人员发现，LhcgrW495X小鼠基因修正的SLCs在体外可分化为有功能的间质细胞，将体外培养的间质干细胞移植到LhcgrW495X点突变小鼠体内明显改善HPH症状。未来有希望通过SLCs人源化治疗人类HPH。