【一周时讯】CRISPR文库筛选：EV-DNA结构在Kupffer细胞介导抗肿瘤免疫中的关键作用
CRISPR/Cas系统是现代生物科学领域的一项革命性技术，其应用已经扩展到医学、农业、生态保护等多个领域，相关成果和应用实例不断涌现。CRISPR那些事儿设置一周时讯栏目，为您带来关于CRISPR的最新研究和行业新闻，以下是过去一周时讯的简单总结：
一、研究资讯
（一）CRISPR 筛选
1、文章题目：Unique structural configuration of EV-DNA primes Kupffer cell-mediated antitumor immunity to prevent metastatic progression
期刊：Nature Cancer（IF：23.5）
原文链接：https://doi.org/10.1038/s43018-024-00862-6
肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因，而宿主免疫系统在抵抗肿瘤转移中起着关键作用。外泌体（Extracellular Vesicles, EVs）是细胞释放的小型膜囊泡，可以携带蛋白质、RNA和DNA等生物分子，在细胞间传递信息。Kupffer细胞是肝脏中的驻留巨噬细胞，是免疫防御的关键细胞，但其在抵御转移中的机制尚不完全清楚。
研究人员证明了 EV-DNA 主要位于囊泡表面并与独特修饰和裂解的组蛋白相关。为了确定功能性EV-DNA片段、鉴定相关受体或通路和优化实验模型，研究人员进行了CRISPR全基因组敲除筛选，结果显示，免疫发育途径和基因（包括凋亡肽酶活化因子 1 (APAF1) 和中性粒细胞胞浆因子 1 (NCF1)）调节 EV-DNA 包装。此外，在结直肠癌模型中，转移前肝库普弗细胞 (KC) 对 EV-DNA 的吸收激活了 DNA 损伤反应。这种激活重新连接了 KC 细胞因子的产生并促进了三级淋巴结构的形成，从而抑制了肝转移。相反，APAF1 的缺失会降低 EV-DNA 的包装并促进肝转移。结直肠癌活检 EV-DNA 分泌可以作为术后转移的预测生物标志物，独特染色质化的 EV-DNA 可诱导抗肿瘤免疫。
2、文章题目：UBA1 inhibition sensitizes cancer cells to PARP inhibitors
期刊：Cell Reports Medicine（IF：11.7）
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2024.101834
PARP抑制剂是一类针对DNA损伤修复（DNA damage response, DDR）缺陷型肿瘤（如BRCA1/2突变肿瘤）的靶向治疗药物。但许多癌细胞因DNA修复功能的补偿机制或其他生存途径，表现出对PARP抑制剂的耐药性。UBA1是泛素化通路的起始酶，负责激活泛素分子。
为了探索UBA1抑制是否可以削弱癌细胞的DNA修复能力，进而增强其对PARP抑制剂的敏感性，研究人员采用全基因组 CRISPR 敲除筛选，发现泛素激活酶 E1 (UBA1) 的消耗增强了 HR 功能正常的卵巢癌细胞对 PARPi 的敏感性。研究表明，沉默或药理学抑制 UBA1 可使多种细胞系和类器官模型对 PARPi 敏感。机制研究发现，UBA1 抑制不仅会阻碍 HR 修复以使细胞对 PARP 抑制敏感，而且还会增加 PARylation，随后 PARP 抑制可能会针对 PARp 修饰。研究揭示了泛素化系统在DNA修复和肿瘤耐药中的新机制，强调了UBA1作为调控DNA修复和增强抗癌疗效的潜在靶点，该策略有望在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多种癌症中实现临床转化。
（二）CRISPR基因敲除细胞
1、文章题目：Identification of SLC35A1 as an essential host factor for the transduction of multi-serotype recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors
期刊：ChemBioEng Reviews（IF:6.2）
原文链接：https://doi.org/10.1128/mbio.03268-24
AAV载体因其安全性和高效性，是基因治疗中最常用的递送工具，可针对多种组织和细胞类型，但其效率受血清型（serotype）和宿主细胞因子的影响。为了鉴定在多种血清型AAV感染中通用的关键宿主因子，解析关键因子的作用机制，利用CRISPR-Cas9基因敲除文库，对宿主细胞进行全基因组筛选，寻找对AAV感染至关重要的基因，经过两轮筛选后发现，经过高度筛选的基因包括之前报道的KIAA0319L、TM9SF2和RNF121，以及一组涉及聚糖生物合成、高尔基体定位和内质网穿透的基因。本研究通过CRISPR基因敲除、过表达及RNA干扰重点探究了溶质载体家族 35 成员 A1 ( SLC35A1 )，结果显示敲除SLC35A1显著降低了AAV的转导效率，揭示了SLC35A1作为AAV多血清型转导的关键因子，拓展了对AAV感染机制的认识，通过调控SLC35A1或唾液酸代谢，可能增强AAV在目标细胞中的转导效率。
2、文章题目：Glycosylation of Ceramide Synthase 6 is Required for Its Activity
期刊：Journal of Lipid Research（IF:5）
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jlr.2024.100715
Ceramide Synthase（CerS）是一类催化神经酰胺生成的关键酶，其功能涉及脂质代谢、细胞信号转导和凋亡调控。其中CerS6主要生成含C16脂肪酸链的神经酰胺，与肿瘤进展、代谢紊乱和神经退行性疾病密切相关。
为了探讨CerS6是否被糖基化及其对酶活性、结构稳定性和细胞功能的影响，研究人员通过CRISPR/Cas9技术敲除CerS6基因后对细胞进行酶活性检测、糖基化影响的验证和细胞功能研究。结果显示，CerS6敲除后酶活性完全丧失，重新表达野生型CerS6可以恢复酶活性，而糖基化突变体（如N/Q突变体）则无法恢复，表明糖基化对于CerS6催化神经酰胺合成的活性至关重要，糖基化可能通过影响蛋白质折叠、酶与底物的结合、或在内质网的稳定性来维持其活性。研究揭示糖基化的新功能，提供了糖基化如何影响神经酰胺生成的新机制，为理解脂质代谢紊乱中的关键调控环节提供了新视角。
（三）CRISPR检测
1、文章题目：An electrochemical biosensor for the detection of tuberculosis specific DNA with CRISPR-Cas12a and redox-probe modified oligonucleotide
期刊：Heliyon（IF：3.4）
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e40754
开发用于检测结核病 (TB) 生物标志物的强大而准确的即时检测平台对于疾病控制至关重要。在当前的研究中，检测原理依赖于在目标 DNA IS6110 存在的情况下粉碎 PES 修饰的非特异性 ssDNA (Poly T)，这是通过 CRISPR-Cas12a 机制进行结核病诊断的可靠生物标志物。Cas 蛋白在核酸检测方面具有巨大潜力。
研究人员利用 CRISPR/Cas12a 的反式切割活性开发出一种生物传感平台，将其应用于电化学生物传感器。在目标 DNA 存在的情况下，通过非特异性 ssDNA 底物 PolyT 链观察到反式切割活性。在构建的生物传感器上测试了不同浓度的目标 DNA，所制造的生物传感器通过 PES 修饰的 poly T 的反式切割成功检测到 TB 目标 DNA。这种新型生物传感器能够通过 CRISPR/Cas12a 的反式切割活性在 60 分钟内检测出目标 DNA IS6110，检测限为 14.5 nM，结果揭示了基于 Cas12a 的生物传感器作为诊断平台的潜力。研究人员开发的基于CRISPR/Cas12a核酸内切酶的电化学生物传感器为结核分枝杆菌的准确检测提供了一个潜在的强大平台。
2、文章题目：End-point RPA-CRISPR/Cas12a-based detection of Enterocytozoon bieneusi nucleic acid: rapid, sensitive and specific
期刊：BMC Veterinary Research（IF：2.3）
原文链接：https://doi.org/10.1186/s12917-024-04391-3
肠细胞寄生虫是一种常见的感染人类和动物的微孢子菌。中国研究人员已验证了一种基于 CRISPR/Cas12a 的肠胞虫诊断检测方法（ReCTC）。该方法的检测限达到 3.7 拷贝/µl，对其他肠道病原体表现出高灵敏度和特异性 ReCTC 优于嵌套 PCR，可有效识别临床样本中的肠胞虫，并显示出快速、现场应用的潜力，为临床诊断提供了一种有前途的工具。
3、文章题目：HRP-Integrated CRISPR/Cas12a Biosensor for Rapid Point-of-Care Detection of Langya Henipavirus
期刊：iScience（IF:4.6）
原文链接：https://doi.org/j.isci.2024.111466
基于CRISPR -Cas12a 的琅琊亨尼巴病毒 (LayV) 生物传感器可实现超灵敏的 RNA 检测，使用 RPA 可实现 10 份/μL 的检测，使用辣根过氧化物酶 (HRP)-ssDNA 报告基因无需扩增即可实现 1200 份/μL 的检测。这种快速、精确且无扩增子的方法为新兴病原体提供了有希望的即时诊断方法，尤其是在资源有限的环境中。
琅琊亨尼巴病毒（LayV）是一种新兴的人畜共患病原体，有可能引起大流行，但缺乏快速诊断工具，特别是即时诊断水平的工具。因此，研究人员利用 CRISPR/Cas12a 生物传感的优点，建立了一种高灵敏度的 LayV 检测方法。通过将 CRISPR/Cas12a 与 RPA 相结合，在室温下 30 分钟内实现了 10 拷贝/μL 超灵敏的 LayV RNA 检测。此外，研究人员开发了一种特殊的辣根过氧化物酶 (HRP)-ssDNA 报告基因，使 CRISPR/Cas12a 无需预扩增即可检测 LayV RNA，实现了肉眼可检测到的 1200 拷贝/μL 的灵敏度。这些探索可以作为CRISPR/Cas生物传感的加速器，以快速应对新出现的生物威胁，并为资源有限或欠发达地区实现简单、精确、无扩增子的即时病原体筛查提供一种方法。
（四）其他CRISPR相关研究
1、文章题目：Genome editing with the HDR-enhancing DNA-PKcs inhibitor AZD7648 causes large-scale genomic alterations
期刊：Nature Biotechnology（IF：33.1）
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-024-02488-6
DNA-PKcs（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit）是与NHEJ修复路径密切相关的一个重要蛋白，它在DNA双链断裂后参与修复过程。如果通过抑制DNA-PKcs，可以增加HDR路径的利用，从而提高基因编辑的精准度。AZD7648是一种DNA-PKcs抑制剂，已知可以通过抑制NHEJ来促进HDR路径，从而改善基因编辑的效率和准确性。为了探究AZD7648对基因组编辑的影响，尤其是其通过增强HDR途径的方式，是否会引起大规模的基因组改变，研究人员对人类细胞系（如HEK293或K562细胞）和小鼠模型进行CRISPR基因编辑时，使用使用AZD7648来抑制DNA-PKcs，从而增强HDR效应并通过基因组测序、荧光显微镜观察或其他方法评估编辑后基因组的变化，包括插入、删除、点突变等。特别关注AZD7648是否在提升HDR的同时，诱发了意外的大规模基因组改变。
结果证明，使用 DNA-PKcs 抑制剂 AZD7648 进行 CRISPR-Cas9 编辑可增强同源性定向修复，但会诱导千碱基和兆碱基级的缺失、易位和染色体臂丢失。这些基因组改变可通过标准测序逃避检测，因此在临床应用中需要谨慎。将 AZD7648 与 PolQi2 结合可减少大量缺失，同时保持 HDR 效率，但兆碱基级事件的挑战仍然存在。
2、文章题目：Engineered transcription-associated Cas9 targeting in eukaryotic cells
期刊：Nature Communications（IF：14.7）
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-54629-9
传统的CRISPR/Cas9系统通过DNA切割进行基因编辑，但这种方法可能导致不稳定的基因组改变和非特异性突变，因此亟需开发新的技术来避免这些问题。为了克服这一挑战，研究者将Cas9蛋白与转录激活因子（如VP64、p300）融合，开发出转录相关的Cas9系统，通过结合目标DNA序列直接调控基因转录，而不进行DNA切割。在方法上，研究者采用了dCas9（即去活化Cas9）与转录因子的结合，以实现对靶基因的转录激活。通过在多种真核细胞系中进行实验，验证了这一系统的高效性和特异性，证明它能够在不引发DNA损伤的情况下，显著提升特定基因的表达水平。
研究结果表明，这种非切割的基因激活系统可以有效激活目标基因的转录，避免了传统基因编辑技术带来的基因组不稳定性问题，并具有较高的靶向性。这一技术不仅为基因治疗提供了新的思路，尤其适用于那些需要激活基因表达而非敲除基因的治疗策略，还可应用于疾病模型的构建和合成生物学的开发。
二、行业新闻
1、Intellia Therapeutics宣布其基因编辑疗法NTLA-2001获得美国FDA授予再生医学先进疗法（RMAT）的认证，用于治疗遗传性ATTR型淀粉样变性（hATTR amyloidosis）。NTLA-2001是一种基于CRISPR/Cas9的治疗方法，旨在通过靶向TTR基因，减少引发疾病的异常蛋白质的生产。获得RMAT认证意味着该疗法可加速临床开发，享受FDA在临床试验、审批等方面的优先支持。这一认证进一步推动了Intellia在基因治疗领域的领先地位，并为治疗遗传性疾病提供了新的希望。
新闻链接： https://ir.intelliatx.com/news-releases/news-release-details/intellia-therapeutics-announces-fda-regenerative-medicine-0
2、Scribe Therapeutics近日公布了其在2024年美国心脏协会（AHA）科学年会上的前临床数据，验证了其CRISPR基因编辑和表观基因组修饰技术在心血管代谢疾病治疗中的潜力。ELXR 平台通过表观遗传沉默在非人类灵长类动物中实现了 6 个月内 LDL-C 降低 67%。XE 平台分别将 APOC3、甘油三酯和胆固醇降低了 90% 以上、97% 和 84%，具有高度特异性且无脱靶效应。这些前临床数据为Scribe在未来应用其基因编辑技术治疗代谢性疾病提供了有力支持。该平台的应用不仅可以推动代谢疾病的基因治疗，也为进一步临床试验奠定了基础，彰显了其在心血管疾病领域的创新潜力。
新闻链接： https://www.businesswire.com/news/home/20241122617151/en/Scribe-Therapeutics-Reports-Preclinical-Data-Validating-its-CRISPR-Genome-Editing-and-Epigenome-Modifying-Technologies-for-Addressing-Cardiometabolic-Disease-at-American-Heart-Association-AHA-Scientific-Sessions-2024
艾迪基因专注于CRISPR技术，提供一系列高质量的基因编辑服务和体外诊断产品：CRISPR文库筛选、细胞基因编辑、单克隆筛选、CRISPR检测。致力于为CRISPR相关、基因功能研究相关、体外诊断以及治疗相关的科学研究提供最高效的技术服务。
近期资讯
- 1.【本月之星】人全基因组 CRISPR/Cas9-KO文库和人RNA结合蛋白文库
- 2.【一周时讯】全基因组CRISPR筛选：揭示新宿主因子，优化轮状病毒疫苗生产
- 3.【文献解读】CRISPR-Cas12a反式切割活性增强新策略：利用变体减少顺式切割产物的空间位阻
联系我们
18102225074（微信同号）
market@edgene.cn