文献解读|CRISPR检测在妇产科的应用
乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是一种常见的细菌，可导致许多疾病，包括肺炎、败血症和脑膜炎。在孕妇中，乳链球菌感染可能会导致早产和胎儿死亡。因此，对于孕妇的乳链球菌感染的快速和准确检测至关重要。
2023年1月，福建医科大学的余红东等人在Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials发表了这篇文章，介绍了一种基于CRISPR/Cas12a技术的检测方法，用于快速、高灵敏度的检测孕妇羊水破裂并感染乳链球菌的情况。在这项研究中，作者利用了CRISPR/Cas12a技术的特点，设计了一种用于检测乳链球菌的DNA分子的试剂盒。该检测方法具有快速和高灵敏度的优点，可以在35分钟内检测出孕妇是否感染了乳链球菌，并且能够检测到非常低浓度的乳链球菌。这种检测方法有望成为一种简单、快速、准确和低成本的诊断工具，帮助医生及时诊断和治疗孕妇的乳链球菌感染，从而保护母婴健康。
图1 CRISPR-GBS流程图
筛选高活性的crRNA
作者根据目标序列的5’-TTTN-3’原间隔相邻基序(PAM)设计了多个crRNA，最终选择了12个目标效率分数为> 0.3的crRNA。同时，根据之前的研究，其发夹结构正确且MFE较低的crRNA比其他的crRNA效率更高。因此，作者使用预测了12个crRNA的二级结构和相应的MFE值，然后选择5种crRNA ，通过测量在两种不同浓度的靶标10分钟和45分钟内产生的总荧光信号来评估效果。表现出较高的性能，因此选择crRNA9用于后续实验评估。
图2 crRNA活性对比
CRISPR-GBS方法优化
为了筛选最佳引物组合，作者设计了9个针对cfb基因的RPA引物组合，结果表明F3 + R1引物组扩增效率最高，该引物组预期产物长度为212 bp。作者还研究了crRNA与LbCas12a的最适浓度比。结果表明2:1的比例更好。此外，考虑到整个CRISPR-GBS检测工作流程适合于现场部署诊断，采用了37°C的反应温度。
图3 CRISPR-GBS体系建立
CRISPR-GBS方法的灵敏度测试
作者使用连续稀释的GBS gDNA评估LoD。结果表明，当浓度≥5copies μL−1时，荧光信号显著增加；CRISPR-GBS检测的LoD为5 copies μL−1，这表明表明其分析灵敏度可与其他CRISPR系统相媲美。作者们还观察到，在10min时，DNA浓度≥5copies μL−1的阳性信号可以与阴性信号清晰区分。这表明CRISPR/Cas12a检测时间可缩短至10分钟。
为了评估CRISPR-GBS检测的特异性，对16种微生物进行了测试，包括几种胃肠道和阴道微生物。除GBS菌株外，被测gDNA均未得到阳性结果，说明CRISPR-GBS法对GBS检测具有较高的特异性。
图4 CRISPR-GBS方法的灵敏度测试
图5 CRISPR-GBS方法特异性分析
CRISPR-GBS方法临床性能分析
本研究共收集了179份胎膜早破孕妇阴道或宫颈拭子标本，以培养-质谱法作为参考方法，评估CRISPR-GBS法的临床性能。通过绘制ROC曲线确定CRISPR-GBS检测的截止值为53259 (a.u);也就是说，荧光信号值高于53259 (a.u)为阳性，而低于53259 (a.u)为阴性。同时，建立qPCR检测作为对比方法，CT截断值为25.89。qPCR方法的LoD为1 copy μL−1。
图6 q-PCR检测对比
在179份标本中，CRISPR-GBS法在149份培养-质谱法阳性标本中鉴定出144份阳性标本，30份阴性标本。在CRISPR-GBS法未检测到的5份样品中，有4份样品也未被qPCR检测到。只有一个样本经qPCR检测为GBS阳性，CT值为23.11，表明gDNA拷贝数较低。总体而言，我们的结果显示临床敏感性为96.64% ，临床特异性为100% 。kappa值(κ)为0.9061 (P < 0.001)，表明CRISPR-GBS法与培养-质谱法之间具有良好的相关性。总体而言，CRISPR-GBS与qPCR检测高度一致，OPA为98.88%，PPA为99.31%，NPA为97.14%。
表1 179份临床样本中，CRISPR-GBS检测与培养-质谱法的比较结果
图7 CRISPR-GBS临床分析试验结果
总结
本研究成功开发了一种新型的CRISPR-GBS检测方法，用于及时检测孕妇羊水破裂的GBS定殖情况。在实验条件上，整个实验方案所使用的孵育温度(加热裂解100℃，RPA和Cas12a/crRNA反应37℃)可以使用任何恒温培养箱，也可以用肉眼获得最终的读出值。此外，CRISPR-GBS检测在速度方面具有突出的优势。总时间在35分钟以内，此外，CRISPR-GBS的人工成本估计仅为0.613美元，与培养-质谱法(4.95美元)和基于qpcr的检测(7美元)相比具有很高的成本效益。该方法快速、便携、经济高效，可作为GBS产时筛查的替代工具。它帮助临床医生在分娩期间确定最合适的IAP，帮助医生及时诊断和治疗孕妇的乳链球菌感染，从而保护母婴健康。