吐血整理CRISPR文库筛选干货，论文轻松拿高分！

随着CRISPR/Cas9 基因编辑技术的迅速发展，CRISPR文库筛选已在药物筛选、病毒感染以及肿瘤功能性基因筛选的实验中发挥重要作用。相比cdna文库与RNAi文库，CRISPR文库筛选具有多功能性、低噪声、高敲除效率、以及脱靶率低等优点，如今已成为科学家们的热门选题。

问：CRISPR文库筛选是什么？

简单来说，crispr基因文库筛选其实就是用来精准筛选出所需要的功能基因的。

问：双载体文库和单载体文库的区别？

单质粒系统：包括了启动子、gRNA、Cas9以及筛选标记，可以同时转入gRNA和Cas9，但是由于单质粒系统过于庞大导致感染效率较低。

双质粒系统：只包括gRNA和最佳启动子，只需要构建稳定表达Cas9的细胞株就可以了，双质粒系统效率更高，修改更方便，但需要转染两次。

今天我们来介绍一下基于双载体系统的CRISPR文库筛选流程以及注意事项，满满干货，看下去吧！

实验步骤

一、Cas9稳转株构建：

（1）Cas9慢病毒包装（2）慢病毒转染和Cas9阳性单克隆细胞筛选（3）Cas9活性验证

二、sgRNA文库构建（现货或定制）

针对某个物种，每个基因设计合成3-6条sgRNA，组装克隆到骨架载体，再进行扩增验证。

三、sgRNA慢病毒文库包装

（1）将sgRNA文库质粒与包装辅助质粒转染混合物缓慢加入T225细胞培养瓶。（2）48h后收集培养上清，分装保存在-80℃冰箱。

四、慢病毒转染（以A549细胞为例）

（1）针对A549绘制嘌呤霉素杀伤曲线，确定筛选所需要的嘌呤霉素最佳浓度。

（2）将慢病毒文库以MOI为0.3的剂量感染2×107个A549-Cas9细胞，相当于6×106细胞被感染，也即文库中的每种sgRNA会被整合到>1000个细胞中。

五、细胞表型筛选（以A549细胞为例）

将全基因组敲除细胞库分成两份

（1）其中一份作为实验组施加筛选压力，如：病毒侵染，药物治疗等；

（2）另一份作为对照组。根据耐药性、增殖能力、存活能力等表型筛选细胞。

注意点：根据筛选目的不同，分为阳性筛选和阴性筛选。一般3组对照和三组样品。

六、NGS测序与数据分析

将实验组和对照组的细胞分别进行：（1）抽提基因组（2）PCR扩增sgRNA片段（3）进行NGS测序（4）生物信息学分析。

七.基因功能验证

从实验的必要性和充分性两个方面进行基因功能验证。

（1）敲除单个候选基因（2）过表达/回补实验。

注意事项

CRISPR文库筛选成功的关键有以下几点

（1）选择敲除效率高的细胞系，是保证获得高覆盖率敲除细胞文库的关键。

（2）筛选范围：对于高通量筛选，文库的大小是影响筛选结果的关键因素之一。尽量选择小文库，优先选用现货文库

（3）慢病毒转染细胞时，确保每个细胞只进入一个病毒。

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