【本月之星】人表观遗传基因敲除文库、鼠全基因组敲除细胞文库、人全基因组激活文库

CRISPR文库筛选是一种基于CRISPR/Cas9技术的高通量基因筛选方案，通过构建包含成千上万个sgRNA的文库，并将这些sgRNA克隆到慢病毒载体中，以低MOI感染靶细胞。这种方法可以确保每个细胞只被一种sgRNA感染，从而实现针对不同sgRNA对应基因的功能筛选。小编为大家推荐本月最畅销的三款CRISPR文库现货质粒，并附上该文库相关研究文献解读，希望能为大家的科研道路添砖加瓦。

一、体内CRISPR文库筛选鉴定Asf1a作为Kras突变型肺腺癌的免疫治疗靶点

原文链接：https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-19-0780

肺腺癌（LUAD）是一种致死率很高的癌症，其中KRAS和EGFR是主要的致癌基因。虽然EGFR突变的LUAD患者可以通过分子靶向治疗治愈，但KRAS突变仍然是直接抑制剂难以捕抓的靶点，需要开发新的治疗策略。表观遗传调控因素在肿瘤免疫微环境中的作用逐渐被认识，越来越多的证据表明，表观遗传因子参与调节肿瘤免疫微环境，可能成为调节抗肿瘤免疫反应的潜在靶点。CRISPR文库筛选是快速鉴定影响肿瘤免疫微环境的基因的新方法。

研究人员构建了一个包含针对524个表观遗传调控因子和173个对照基因（包括必需基因和免疫调节因子）的表观遗传基因敲除文库，这个文库在体内CRISPR筛选中用于Kras G12D/Trp53−/−（KP）LUAD模型，以鉴定能够增强肿瘤对抗PD-1治疗敏感性的表观遗传调控因子。筛选数据结果显示，肿瘤细胞中组蛋白伴侣Asf1a的缺失可以使肿瘤对抗PD-1治疗更加敏感，Asf1a的缺失促进M1样巨噬细胞的分化和增强T细胞激活增强了免疫反应。通过表观遗传基因敲除文库筛选，发现新的治疗靶点Asf1a，为KRAS突变型LUAD患者提供了一个潜在的新治疗靶点，对于开发新的癌症治疗策略具有重要意义。

图1 表观遗传基因敲除文库筛选鉴定Asf1a作为抗pd -1治疗反应的负调节因子

二、鼠全基因组敲除文库助力Hedgehog 信号传导调控机制研究

原文链接：https://doi.org/10.1101/699819

HH信号通路在胚胎发育、组织再生和肿瘤发生中扮演着重要角色，G蛋白偶联受体家族蛋白Smoothened (SMO)是HH信号传导的关键介质，它通过与胆固醇的直接相互作用来传递信号穿过细胞膜。然而，胆固醇是如何被精确调控以控制可能导致出生缺陷和癌症的信号系统这一问题尚未解决。

在这篇文章中，研究人员使用Brie Mouse CRISPR Knockout Pooled library（鼠全基因敲除文库）作为筛选工具。研究人员使用NIH/3T3-CG细胞系，该细胞系表达Cas9并且含有一个由HH信号响应的荧光报告基因（GLI-GFP），细胞在低血清和U18666A的条件下培养，以确保对内源性脂质代谢途径的扰动敏感。筛选结果成功识别了所有四个阳性对照：Smo和Adrbk1（或Grk2）作为Hh信号通路的正向调节因子，Ptch1和Sufu作为负向调节因子。鼠全基因组敲除文库揭示了胆固醇生物合成途径中基因的突变对HH信号通路的正向调节作用，确定了鞘磷脂生物合成途径中的基因是HH信号强度的负向调节因子，为理解胆固醇如何作为内源性甾体脂质调节SMO激活提供了遗传学证据，对于开发治疗相关疾病的潜在策略具有重要意义。

图2 CRISPR筛选确定影响Hedgehog信号传导的脂质相关基因

三、人全基因组激活文库筛选参与HCC中索拉非尼反应调节的关键lncRNA

原文链接：https://doi.org/10.1186/s12943-024-01988-y

肝细胞癌是全球第五大致命癌症。索拉非尼是首个被FDA批准用于晚期和终末期HCC系统治疗的一线药物，它是一种酪氨酸激酶抑制剂，能够阻断对HCC生长和增殖相关酶活性，并展现出抗血管生成效应，从而延长HCC患者总生存期。常见的索拉非尼耐药机制包括转运蛋白和药物靶点的变化，以及信号通路的变异。越来越多的证据表明，非编码RNA，包括长非编码RNA（lncRNAs）和微小RNA（miRNAs），是HCC生物过程的重要调节因子，为确定参与HCC中索拉非尼反应调节的关键lncRNA，研究人员开展了相关研究。

研究人员使用CRISPR/Cas9协同激活介质（SAM）文库筛选受索拉非尼治疗调控的关键lncRNA。结果表明，lncRNA LINC01056是在索拉非尼耐药的HCC细胞中最显著下调的lncRNA之一，Linc01056的敲低（KD）会减少HCC细胞对索拉非尼的敏感性，抑制体外细胞凋亡，并促进小鼠体内肿瘤生长。从机制上，研究人员确定了PPARα是调控Linc01056敲低后HCC细胞中代谢转换的关键分子，PPARα的抑制恢复了HCC细胞和肿瘤对索拉非尼的反应。Human CRISPR/Cas9 SAM pooled libraries揭示了Linc01056作为一个关键的表观遗传调控因子和潜在的治疗靶点在调控HCC中索拉非尼反应的作用，为开发针对索拉非尼耐药HCC的新治疗策略提供了可能的方向。