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DNA恒温快速扩增试剂盒（液体胶体金试纸条型）
使用说明书
【产品名称】
通用名称：DNA恒温快速扩增试剂盒（液体胶体金试纸条型）
【包装规格】
货号：WLN5002
规格：100T
【原理概述】
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。依赖nfo酶的作用，加入根据模板设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。
【引物设计】
建议使用长度在 30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；下游引物的5’端标记一个修饰基团（常用生物素）。
引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。
【探针设计】
探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有三个修饰位点：5’端修饰一个抗原标记（典型FAM）;在5’端和3’末端的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为nfo的识别位点；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer等。
【试剂盒组成】
|
组成 |
含量 |
|
C buffer |
1 mL×2管 |
|
L buffer |
500 μL×1管 |
|
P-core |
1.2 mL×1管 |
|
N-core |
60 μL×1管 |
|
B buffer |
300 μL×1管 |
|
使用说明书 |
1份 |
【试剂盒储存】
1．运输温度：≤ 20 ºC的恒温环境；
2．储存条件：储存温度 ≤ -20 °C的恒温环境，避光保存，避免重压、反复冻融；
3．产品有效期：6个月；
4．生产日期见外包装。
【操作步骤】
提前将试剂盒所需组分取出，冰上或低温下融化（C buffer可室温融化），震荡混匀。
(1) 向无菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；
(2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针，
(3) 加入1.5μL dNTPs(10 mM)；
(4) 加入12 μL P-core和0.6 μL N-core（步骤1~4可以混合后再分装至反应管中）；
(5) 向反应管中加入3.8 μL核酸模板；
(6) 最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（请务必上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧上下颠倒后混匀）；
(7) 混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中39 ºC孵育8-12 min；
(8) 反应结束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的离心管中，混合均匀后，将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡，5 min内观察质控线与检测线判读结果。
体系配制
|
组分 |
体积（μL） |
|
C buffer |
20 |
|
L buffer |
5 |
|
P-core |
12 |
|
N-core |
0.6 |
|
dNTPs(10 mM) |
1.5 |
|
下游引物(10 μM) |
2 |
|
下游引物(10 μM) |
2 |
|
探针(10 μM) |
0.6 |
|
核酸模板 |
3.8 |
|
B buffer |
2.5 |
|
总体积 |
50 |
【注意事项】
1. 由为保证液体试剂组分活性，请保证储存温度 ≤ -20 ºC；试剂使用时请保持低温，避免高温放置过长时间；
2. 在进行反应时请注意避免微量核酸染，并设置空白对照实验组。
